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四种常见饲用酵母源产品的光镜与电镜显微观察
2018/4/19 17:20:07雅琪三升体育全讯足球

酵母菌随着现代三升体育全讯足球的发展,应用的范围越来越广泛,已经渗透到饲料、医疗、三升体育全讯足球、化妆等诸多领域,在养殖领域,酵母菌源产品具有改善肠道消化吸收、促进动物生长、增强动物免疫力和抗应激力等作用,并且具有较强的诱食效果 [1-10]。随着产业和加工技术的发展,相应产生的酵母衍三升体育全讯足球越来越多,当种类繁杂的酵母源产品进入市场时,消费者只是根据产品简介了解酵母产品的作用,不能直观地区分出不同产品的特征。目前仅国标GB/T 22547-2008规定了酵母活细胞数的显微三升体育全讯足球方法——次甲基蓝法,但是对酵母类的其他产品,比如酵母细胞壁与酵母水解物,仍没有镜检区分的标准。由于产品的结构与其发挥的生理功能是密不可分的,如果能够用图片的形式直观地说明酵母源产品的结构,有助于使用者更好地明白酵母类产品的作用机理,更有针对性地使用这些产品。在已发表的文献中酵母源产品形态特征方面鲜有论述,因此,有必要开展相关的研究。


本研究选取了市场上常见的具有代表性的几种酵母源产品,选择的依据主要是应用范围较广与效果较为明显的产品种类,共选择了4种产品,包括酵母水解物、酵母细胞壁、啤酒酵母粉和活性干酵母。酵母水解物氨基酸和小肽稳定且具有高消化率,在动物的蛋白质营养方面具有显著优势;酵母细胞壁作为高效免疫因子,可以直接食用;啤酒酵母粉为传统的蛋白质饲料;活性干酵母是微生态制剂中常用的组分。三升体育全讯足球的主要目的是通过对染色方法进行改进,获得酵母源产品较为清晰的显微图片及扫描电镜图片,并拍照记录。通过对不同酵母源产品图片的相互对比,描述形态特征,从而明确区分不同酵母源产品的生理特性


1 三升体育全讯足球与方法

1.1实验三升体育全讯足球

1.1.1试剂与三升体育全讯足球

酵母水解物、啤酒酵母粉、酵母细胞壁、活性干酵母均由广东雅琪三升体育全讯足球技术有限三升体育全讯足球微三升体育全讯足球学实验室提供。酵母水解物为采用糖蜜发酵生产后,经过自溶、酶解、喷雾干燥等工艺制成的黄色粉状物,蛋白质含量不小于50%,水分含量不大于8.0%;啤酒酵母粉为啤酒酵母酵母干燥粉碎制成的粉状物,粗蛋白质含量为42.8%,水分含量不大于10.0%;将酵母水解物离心分离细胞内容物,留下的细胞壁经过干燥制成酵母细胞壁多糖,β-葡聚糖含量不小于20%,甘露寡糖含量不小于20%活性干酵母(饲用高活性干酵母),白色短杆状,酵母活细胞数200亿个/g


蒸馏水0.1 mol/L磷酸盐缓冲溶液 PBS (pH=7.2)2.5%戊二醛(5 mL 50%浓度的戊二醛,溶于95 mL PBS)乙醇的梯度水溶液(浓度为30%50%70%80%90%乙酸异戊酯草酸铵结晶紫染液碘液95%酒精溶液磷钼酸染液甲基绿。


1.1.2三升体育全讯足球与设备

Hitachi S-4800 Field Emission Scanning Electron Microscope扫描电镜、普通光学显微镜、冷冻干燥机等。


1.2 三升体育全讯足球方法

1.2.1酵母源产品光镜显微观察

1)取样品。对4种酵母源产品进行编号(1~4),每种样品取1g3个重复,并溶于20 mL蒸馏水中。

2)制片。制作装片之前,由于酵母源产品容易沉淀,首先对样品进行搅拌混匀,再用胶头滴管取少量样品滴在玻片上,干燥固定。这一过程结束后,先对样品进行一次观察,并拍照记录其形态。

3)染色。在已经固定好的玻片上滴加草酸铵结晶紫染液1~2滴,染色1—2 min,水洗,除尽水滴。在玻片上滴加碘液,平放1—3 min,水洗。加95%酒精溶液脱色30—60 s,水洗。再用磷钼酸染液复染5 min,用水冲洗后,最后用甲基绿染色1 min,水洗,干后镜检[11]

4)对比不同的三升体育全讯足球样品,分别在不同放大倍数下进行观察,选择每组中相对较为清晰且具有代表性的图片进行拍照记录


1.2.2酵母源产品的扫描电镜观察

1酵母源产品的前处理取样。0.5 g样品,溶于10 mL 0.1 mol/L PBS (pH=7.2),稍搅拌去除上清液,加入等量的PBS清洗三遍,清洗时每次添加清洗液要充分搅拌,保证菌体与清洗液的充分混合。固定。2.5%戊二醛(5 mL 50%浓度的戊二醛,溶于95 mL PBS)4 固定3 h,之后用PBS清洗三次,每次10 min,具体的清洗步骤同梯度脱水。用乙醇的水溶液分别按30%50%70%80%90%的浓度梯度对样品进行脱水,每步15 min,之后在100%乙醇的水溶液中脱水2次,每次15 min,再将样品置于乙醇和乙酸异戊酯1:1混合液中15 min,最后置样品于乙酸异戊酯15 min×2以彻底去除乙醇保持细胞原有形态(若没有乙酸异戊酯,可以叔丁醇替代)。干燥保存。将处理好的样品倾置于小培养皿中,置-80 冰箱冷冻保存,之后放入冷冻干燥机中干燥,制成粉末状,装袋。


2)酵母源产品的扫描电镜观察。

Hitachi S-4800场发射扫描电镜对样品进行亚显微观察。样品按照该扫描电镜的操作规范进行处理。首先将经过预处理的样品粉末状)撒到导电胶上,用吸耳球或高压氮气吹扫掉导电胶上未粘紧的样品粉末。固定好后对样品进行喷金处理,使导电再将制备好的样品放到样品室进行观察,样品室真空度小于 E-3 Pa。设定合适的加速高压和发射电流发射电流设为10 μA选择图形信号及探测器类型为BSE,高度Z5 mm。加高压后对中并聚焦,在电脑显示屏上即获得显微图像对整个酵母产品样品表面进行观察,扫描速度设定为Slow 3选择具有代表性的区域进行拍摄,并且在不同放大倍数下进行拍摄,以利于后期的图片对比观察。


2三升体育全讯足球结果与讨论

2.1酵母源产品显微图片及三升体育全讯足球

2.1.1 酵母源产品的直接光学显微镜观察

就酵母的直接显微观察而言,图1可见啤酒酵母粉能观察到完整的酵母细胞,细胞呈分散状,轮廓较为分明,能看到细胞壁、液泡等结构(图1,黑色箭头示)。对于酵母细胞壁产品(图2),许多酵母细胞会倾向于粘结在一起呈团状,几乎无法看到完整细胞之间的界限。


由图3活性干酵母和图4酵母水解物对比观察到,两者酵母细胞基本保持了完整形态。活性干酵母细胞外表有光泽,形态饱满,不透明呈淡绿色。而酵母水解物个体明显偏大,变薄,透光性高,颜色暗淡可清晰看到酵母细胞内呈黑点状的贮藏颗粒(图4)。


2.1.2 酵母源产品的改良革兰氏染色观察

就酵母源产品的改良革兰氏染色观察而言,图5显示啤酒酵母粉的细胞溶解破裂,里面的内容物(浅蓝色物质)析出(黑箭头示)。而使用染色方法可以非常容易地区分出破裂的细胞壁组分(图6,黑箭头示围绕在酵母细胞外的细胞壁组分)。酵母水解物细胞在显微镜下显示浅绿色,透明,贮藏颗粒在细胞内呈黑点状(图8)。而活性干酵母细胞染色后呈深蓝色(图7),内部组织无法看清。


2.2酵母源产品的扫描电镜图片及三升体育全讯足球

从酵母源产品的扫描电镜可以看出,对于酵母水解物,可见细胞膜破裂溶解,显露细胞内容物(图9,白箭头示)。而对于啤酒酵母细胞壁,则可见大量细胞壁成分堆叠在一起,酵母细胞仅剩下一个个变形的空壳,偶见一两个略为完整的酵母细胞(图10,白箭头示)。就细胞形态而言,普通啤酒酵母粉细胞表面特征和活性干酵母差别不大(图11,图12),但是活性酵母细胞大小仅约4 μm,而啤酒酵母粉酵母细胞直径约8~10 μm,差异明显。两种产品酵母细胞均有形成芽体的个体。 


3 讨论

尽管酵母菌在自然界中存在的种类较多,但是在动物饲料领域实际利用开发的种类并不多。列入农业部最近三年发布的《饲料原料目录》、《饲料原料目录》修订列表、《饲料添加剂品种目录》饲料原料及添加剂目录中的酵母源产品有:啤酒酵母粉、啤酒酵母泥、产朊假丝酵母蛋白、食用酵母、酿酒酵母水解物、酿酒酵母细胞壁、酿酒酵母提取物、酿酒酵母培养物、产朊假丝酵母和酿酒酵母。目前活性干酵母、啤酒酵母粉、酵母细胞壁等产品市场接纳度相对较广,使用也相对较多。本研究证实,这些产品能都拥有其较典型的形态特征,可在显微镜下辨别出来。


从形态观察来看,简单的用蒸馏水稀释,可直接在显微镜下观察出活性干酵母与啤酒酵母粉的细胞形态。活性干酵母显得特别饱满,外表有光泽这也是酵母细胞的原本三升体育全讯足球形态(图3);而啤酒酵母粉细胞丧失光泽,明显干瘪,透性增大(图4)。这会是区分两者的主要方法。这些形态特征也与它们在动物营养中的主要功能——改善肠道环境和作为蛋白源物质密切相关的。当然活性干酵母本身也可作为营养物质,已有大量的研究显示,活性酵母能提高断奶仔猪生产性能和免疫功能,改善奶牛瘤胃体外发酵特性,而啤酒酵母粉用于大菱鲆幼鱼的饲养,可替代达17%的鱼粉[12-15]


使用改良的革兰氏染色方法,将革兰氏染液第4液的稀释沙黄液改为磷钼酸液和甲基绿液复染后酵母菌细胞壁被染成深绿色细胞浆为蓝紫色在显微镜下易与其他成份区别。使用这种方法,对于酵母水解物与酵母细胞壁成分区别明显,酵母水解物渗出的细胞内容物、细胞壁碎片清晰可辨(图5,图6)。到了扫描电镜的放大倍数,这种区别更为明显。酵母水解物可见细胞膜破裂溶解,显露细胞内容物(图9)。在这种情况下,动物分泌的消化酶能更容易地接触酵母内部的营养物质,消化吸收率得到提高。在生产实践上酵母水解物可替代血浆蛋白粉在断奶仔猪上使用[16],提高7~63日龄仔猪的日增重量[17]。并且替代饲料中的鱼粉可以提高凡纳滨对虾对饲料的消化机能[18]


而对于啤酒酵母细胞壁,则可见大量细胞壁成分堆叠在一起,酵母细胞仅剩下一个个变形的空壳(图10),在普通光学显微镜下为成块状的细胞碎片结构(图2,图6)。这些散乱的细胞壁碎片,充当着信号分子的作用,被动物免疫细胞识别后能很好地提升整个机体的免疫水平啤酒酵母细胞壁作为一种免疫增强剂在母猪、蛋鸡、异育银鲫养殖上均有积极的效果[19-21]


本文所采用的4种实验三升体育全讯足球,均来自在畜禽养殖生产一线的商业化产品,这些产品有多年的市场应用实践,能够在一定程度上反映出市场上主流的酵母源三升体育全讯足球饲料概况。由于在现实中尚无酵母源饲料的所谓“标准参考产品”(尽管酵母菌作为模式种对其形态特征已了解相对清楚),以这些三升体育全讯足球三升体育全讯足球作为论述酵母源饲料的典型特征,可能不够恰当。事实上关于酵母及其衍三升体育全讯足球典型特征的报道非常少,商业市场仍处于初级阶段,大多数从业者了解仍不透彻。


再从生产工艺上看,在制备酵母细胞壁成分时,需首先通过酶法或自溶法将酵母细胞破壁水解,再通过高速离心分离细胞内容物(这些细胞内容物经喷雾干燥后成为酵母精),即获得细胞壁成分 [22]。因此从这个意义上说,细胞壁产品为酵母水解物的深加工产品。工业化的高速离心手段很难将体系中悬浮的所有酵母细胞都除去,因此造成了用普通光学显微镜观察不同酵母组分产品时都能看到完整的酵母细胞。


因此,在判断这些产品的质量时,不能仅依赖显微镜观察,而应充分考虑其理化指标。比如,对于酵母水解物,粗蛋白质、氨基酸态氮、甘露聚糖和水分等是其强制性标识要求。而对于酿酒酵母细胞壁,甘露聚糖和水分是其强制性标识要求。消费者与企业质检部门均需全面考虑以判断产品质量。


目前我国农业部公告中允许使用的酵母类产品大部分都集中在酿酒酵母属的种类,总体而言精细化加工程度是不高的,酵母类产品在农牧业的市场前景将非常广阔,值得进一步工业化研究。


4

1)应用不同的染色方法和技术手段,在显微镜下区分出酵母水解物、酵母细胞壁、啤酒酵母粉(烘干)和活性干酵母这4种酵母源饲料产品是可行的。这4种产品均有各自明显的形态特征,这些形态特征与其发挥的生理功能是密不可分的。


2)在判断酵母源产品的质量时,仅依赖显微镜观察是不够的,需根据不同产品,结合其不同的理化指标全面考虑。


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